増幅条件で主に検討が必要な項目は、以下の通りです。

①アニール・伸張温度（中温と呼んでいます）
②アニール・伸張時間
③変性温度（＝ホットスタート温度：高温と呼んでいます）
④ホットスタート時間
⑤変性時間

これらも具体的数字は検査対象によりますが、

③は通常９５℃
④は１５秒程度
⑤は４～５秒で十分な事が多いです。

従ってポイントは①と②です。

中温の温度はプライマーとプローブのTm値に依存しますが、プライマーのTm値の数℃下が良さそうです。中温の温度は最適値より上げると急激に反応が悪くなり、一方で下げても反応は徐々に悪くなる程度ですので、試しに増幅する時は低めで始めて徐々に上げていくことをお勧めします。

中温の時間は始めは少し長めに設定し、徐々に短くしていき最適な時間を見つけることをお勧めします。