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リアルタイムPCRとは


リアルタイムPCR

リアルタイムPCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)とは定量PCR(Q-PCR)のひとつで、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅をリアルタイムに測定することで、その増幅率に基づいて鋳型DNAの定量を行なう方法です。
この定量は蛍光色素を用いて行うのが一般的で、インターカレーション法、ハイブリダイゼーション法、LUX法等があります。インターカレーション法では、2本鎖DNAに特異的に挿入(インターカレート)して蛍光を発する色素(SYBR green I)を用いますが、一方、ハイブリダイゼーション法ではTaqManプローブを用いる方法が最も一般的、DNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を修飾したプローブ(TaqManプローブ)を用います。


SYBR Green法

SYBR green法の利点は、プローブの設計や用意を必要としないため、プローブアッセーと比べ安価であるとされています。しかしながら、欠点として、プライマー二量体のような非特異的な2本鎖DNAも検出してしまうこと、マルチプレックス解析が行えないことが挙げられます。 一般的には、プライマー二量体が非特異的に検出されていないかを確認するために融解曲線分析を行います。


融解曲線分析

融解曲線分析ではPCR後に、反応液の温度を徐々に上昇させ、SYBR Green のシグナルを検出します。温度が低い時は、2本鎖を形成しているので、蛍光シグナルが検出されますが、温度が徐々に上昇し、融解温度に達すると、この2本鎖が解離して1本鎖にり、蛍光シグナルが急激に低下します。通常、プライマー二量体がない場合、反応液内の2本鎖形成をしているのは1つの増幅産物であるため、融解曲線のピークは1つとなりますが、反応液内で、目的産物以外が増幅されたり、プライマー二量体形成が認められる場合は、ピークが2つ以上認めらます。このような場合には、増幅産物を電気泳動しバンドが1つであるか確認する必要が出てきます。


TaqManプローブ法

TaqManプローブ法 図解
TaqManプローブ法では、配列特異的なオリゴヌクレオチドに「レポーター」と「クエンチャー」を標識したプローブを用います。Realtime PCRではレポーターからの蛍光を検出することでその増幅を確認します。「レポーター」にはFITC等の蛍光色素を用いることが多く、一方、「クエンチャー」は、「レポーター」の蛍光を消光させる標識物です。PCR反応がすすむと、TaqManプローブが加水分解され、「レポーター」と「クエンチャー」の距離が離れ、蛍光シグナルを発するようになります。この蛍光を検出することでPCR産物量を定量することが出来ます。TaqManプローブ法の利点は、特異的な配列をもつプローブを用いるため、SYBR Green法のようなプライマー二量体の非特異的な検出がない点で特異度にすぐれています。また、複数のプローブに別の蛍光物質を標識しておけば、マルチプレックス解析を行うことも可能です。

定量RT-PCR

リアルタイムPCR(real time PCR)は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse transcription PCR; RT-PCR)と組み合わせて少量のmRNAの定量へ使われ、これにより特定の時間、細胞、組織での遺伝子の発現をみることができます。この組み合わせによる技法を"定量RT-PCR" (quantitative reverse transcription PCR) 法と呼びます。 リアルタイムの装置の中で逆転写反応を行うOne-step RT-qPCRと、あらかじめ作成しておいたcDNAを用いてRT-qPCRを行うTwo-step RT-qPCRに大きく分けられる。前者はDNAの増幅で用いるものと同じプライマーを用いて逆転写反応を行う方法であり、感度、特異度が高く微量RNAの検出に優れています。また、チューブを移し替える回数が減るので、簡便でコンタミネーションの危険も少なくなります。

定量方法

Realtime PCRでの定量方法は、コピー数を算出する絶対定量法と相対値で発現を調べる相対定量法に分けられます。 絶対定量法とは、あらかじめ濃度の分かっている目的産物のDNAを段階希釈し、希釈系列を用いてReal time PCRを行い検量線を得、濃度不明のサンプルのCt値を検量線にあてはめコピー数を計算します。一方で、相対定量法は、主にmRNAの発現の定量に最も一般的に用いられている方法で、目的遺伝子とリファレンス遺伝子を同時に解析しリファレンス遺伝子に比べ、目的遺伝子がどれだけ発現しているかを相対的に比較したものです。


リアルタイムPCRの原理

2本鎖DNAは、水溶液中で高温になると「変性」(熱変成)し、1本鎖DNAに分離します。「熱変性」が起こる温度は、DNAの塩基構成および長さによって異なり、長いDNAほど高い温度です。
高温に曝されされて1本鎖DNAとなった溶液を冷却していくと、相補的なDNAが互いに結合し再び2本鎖となります(アニーリング)。
PCR法では、増幅対象(鋳型)DNA、DNA合成酵素(DNAポリメラーゼ)および大量のプライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドを予め混合し、前述の熱変性・アニーリングを行います。その結果、長い対象1本鎖DNAの一部にプライマーが結合し、プライマーがDNAよりも圧倒的に多い状況にしておくことで、DNA-プライマー間の結合がDNA-DNA間(鋳型の2本鎖に戻ろうとする)結合より、優先的になります。
この状態でDNAポリメラーゼが働くと、プライマーが結合した部分を起点として1本鎖部分と相補的なDNAが合成されます。その結果、熱変成→アニーリングが1回完了すると、理論的には元々あった鋳型DNAの数が2倍になります。その後、再び高温にして熱変性から繰り返すことにより、元々存在していたDNAが指数関数的に増幅されていくことになり、30回後には、元の鋳型DNAの約10億倍量になります。
すなわち、PCR法は、熱変性とアニーリングを利用して、温度の上下を繰り返すだけでDNA合成を繰り返し、DNAを増幅する技術ということになります。
PCRサイクル図